不同产地佛手指纹图谱及模式识别研究
吴春蓉1,2,3,黎珊珊1,2,3,肖雪1,2＊＊,朴胜华1,2＊＊,郭姣1,2
摘 要：目的：建立不同产地佛手指纹图谱，利用模式识别方法比较不同产地佛手的差异。方法：本文采用高效液相色谱法对4个产地25批佛手建立高效液相指纹图谱，利用相似度评价技术、聚类分析、主成分分析进行分析研究。结果：从已建立的佛手指纹图谱中确定26个共有峰，指认出4个共有峰，利用聚类分析、主成分分析可区分佛手产地。结论：研究结果表明，不同地理位置佛手药材相似度存在一定差异，地理位置相近的佛手药材相似度较高。
佛手为芸香科植物佛手Citrus medica L.var. Sarco-dactylis Swingle的干燥果实，其味辛、苦、酸、温，归肝、脾、胃、肺经，具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰的功效。目前研究表明佛手具有抗氧化、抗炎、抗菌、降脂，抗肿瘤等多种药理作用，其作为原材料被广泛用于药品、保健品、食品。《中国药典》采用显微鉴别、薄层色谱及橙皮苷含量评价佛手质量，而佛手成分复杂，产地众多，品质参差不齐，诸如以上方法无法全面表征佛手质量。指纹图谱在中药质量评价中正在被广泛应用，它可充分地反映中药中各化学成分分布的整体状况。聚类分析是一种无监督的多元统计方法，能够依据各自特征进行合理分类。主成分分析通过降维，可用较少的主成分来反映原始指标的主要信息。目前指纹图谱结合模式识别来反映中药不同产地间差异及内在质量的方法已经被广泛应用。林乐维等，张瑞芳等分别建立了广佛手高效液相指纹图谱，结果显示广东地区佛手差异性较小，除此之外，全国其他产区佛手综合研究相对较少。本文首次采用高效液相(High performance liquid chromatog⁃raphy，HPLC)指纹图谱技术结合模式识别方法分析不同产地多批次佛手间的差异，为评价不同产地佛手质量及其应用提供依据。
1 仪器与试药
Waters alliance e2695高效液相色谱仪，配备e2695分离模块，柱温箱，2998 PDA检测器，Empower色谱工作站(美国 Waters 公司)；KQ5200E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ELGA超纯水机(法国威立雅集团)；Sartorius BS110S万分之一电子天平(德国赛多利斯集团)；LD-200型高速多功能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；2012 版中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会)。对照品橙皮苷(批号：wkq15123105)、甲基橙皮苷(批号：wkq151222002)、新橙皮苷(批号：wkq16041804)、橙皮素(批号：wkq16071104)均购自四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均≥98%。甲醇(色谱纯，美国Merck 公司)；乙酸(色谱纯，天津科密欧化学试剂公司)；水为超纯水，其余试剂为分析纯。佛手药材均为市售，经广东药科大学李钟副教授鉴定为芸香科植物佛手Citrus medica L. var. Sarcodactylis Swingle的干燥果实。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液制备取本品适量，粉碎，过 65 目筛，取约 2 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，称定重量，超声提取2次，每次30 min，放冷，甲醇补足重量，将两次提取液混合，浓缩至20 mL 定容，用 0.45μm微孔滤膜滤过备用。
2.2 对照品溶液制备
精密称取对照品适量，置20 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别制成每1 mL含橙皮苷532.0 μg、橙皮素507.0 μg、甲基橙皮苷508.5 μg、新橙皮苷530.0 μg的溶液，经0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。
2.3 色谱条件
色谱柱为 Sharpsil-U C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.2% 乙酸水(B)(pH=3.30)；洗脱方法为(0-14 min：5%-27%B；14-19 min：27%-44%B；19-45 min：44%-80%B)；流速为1 mL·min-1；检测波长为254 nm；柱温30℃；进样量20 μL。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度考察取样品GD01按“2.1”项所述方法制备佛手供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行检测，连续进样6针，记录所得色谱图。以峰24为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积并计算相对标准偏差。结果显示，色谱峰的相对保留时间RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明仪器的精密度良好。
2.4.2 重复性考察
取样品GD01，按“2.1”项下方法平行制备6份佛手供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行检测，各供试品溶液进样分析，记录所得色谱图。结果显示，色谱峰的相对保留时间RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明方法重复性良好。
2.4.3 稳定性考察
取样品GD01，按“2.1”项下方法制备1份佛手供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进行测定，记录色谱图。结果显示，色谱峰的相对保留时间RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明样品24 h内稳定。
2.5 指纹图谱的建立及评价分析
2.5.1 样品及对照品测定分别取“1.1”中收集的 25 批佛手药材和 4 种对照品，按“2.1”项所述方法制备溶液，按“2.3”项色谱条件进样测定，记录 HPLC 图谱，25 批样品色谱叠加图如图1。
2.5.2 参照峰的确定在各批次样品图谱24号色谱峰分离良好，峰面积较大且为所有样品共有，确定甲基橙皮苷的色谱峰为参照峰。
2.5.3 佛手药材指纹图谱共有峰的确定
采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)”对25批佛手药材HPLC图谱进行结果分析，确定26个共有峰，指认了其中4个色谱峰的归属：峰22为橙皮苷，峰23为新橙皮苷，峰24为甲基橙皮苷，峰26为橙皮素。
2.5.4 相似度评价
将所得25批佛手HPLC图谱的cdf格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012 年版)”，选定GD01作为参照峰，时间窗口设为0.1 min，以中位数法建立对照指纹图谱，如图2；25批样品与对照图谱之间的相似度结果如表2。结果表明，收集到的25批不同产地的佛手具有一定的差异，广东佛手相似度在0.846-0.978之间；广西相似度在0.861-0.970之间；四川佛手相似度范围为 0.811-0.926 之间；浙江相似度0.739-0.857之间。
2.6 模式识别分析
2.6.1 聚类分析(The cluster analysis，CA)对25批佛手进行聚类分析，获得包括甲基橙皮苷(峰24)在内的26个共有色谱峰，将各个共有峰面积导入SIMCA-P+13.0(Demo)软件。根据聚类分析结果(图3)，25批佛手样品分为4类，其中SC02-S05及GD05聚为一类，ZJ01-ZJ03聚为一类，其余GX、GD交叉分布聚为两类。
2.6.2 主成分分析(principal components analysis，PCA)
将25批佛手样品所得峰面积导入SIMCA-P+13.0(Demo)，采用PCA方法进行分析，25批样品的得分图见图 4。表明样品间的聚类情况，25 批样品可分为 4组，其中浙江与广东、广西、四川偏离较远，四川与广东、广西有略微差异，广西、广东聚类程度较高，GD05和GD08为广东产地的离群点，此结果与CA结果一致。
3 讨论
3.1 样品条件的选择本文对不同提取方法(超声、回流)进行了比较，并对不同的提取溶剂(10%、20%、40%、60%、80%、100%甲醇及水)以及提取次数(1 次、2 次)进行了试验筛选。结果显示，以80%甲醇为提取溶剂，采用超声提取2次，每次30 min 时所得供试品溶液的色谱峰信息较为丰富，因此确定该条件为提取条件。
3.2 色谱条件的优化
本文分别对甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%乙酸水、乙腈-0.2%乙酸水等多种流动相系统，采用DAD全波长扫描进行考察，最终采用甲醇- 0.2%乙酸水(pH3.30)溶液为流动相梯度洗脱。同时检测波长为254 nm，柱温30℃时各色谱峰分离效果最好。
3.3 不同产地佛手对比
相似度评价表明同一产地佛手相似度较高，广东、广西相似度较为相近，四川佛手与两广佛手略有差异，浙江金佛手与两广、四川佛手均具有明显差异，为了进一步说明不同产地佛手的聚类情况，在此基础上采用CA、PCA方法对25批样品进行分析，CA及PCA的结果与指纹图谱的结果几乎一致，表明不同区域的气候条件、生态环境对其地域内所产的药材质量有很大的影响。因此针对不同产地佛手之间的差异，对其应用应因地制宜。通过HPLC指纹图谱及模式识别对佛手的综合评价，既说明不同产地佛手的整体特征，反映其内在质量，又进一步结合模式识别方法分析不同产地佛手的聚类情况，使结果更科学、全面。对于不同产地佛手差异性成分，今后将做进一步的分析，期望能够全面展示不同产地佛手之间的差异，为控制其内在质量提供依据。
文章来源：吴春蓉,黎珊珊,肖雪,朴胜华,郭姣.不同产地佛手指纹图谱及模式识别研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2017,19(05):820-824.版权归原创作者所有。猎药人转载只为传播中药知识，不做商业用途，如不适合转载，请后台留言联系编辑，本平台将予以删除处理。感谢原作者的辛劳研究与付出。
