ANNOVAR 注释软件
ANNOVAR简介
ANNOVAR结构
ANNOVAR下载数据库
ANNOVAR输入格式
ANNOVAR格式转换
ANNOVAR注释功能
用table_annovar.pl进行注释（可一次性完成三种类型的注释）
Gene-based Annotation(基于基因的注释)
ex1.variant_function
ex1.exonic_variant_function
Region-based Annotation（基于区域的注释）
Filter-based Annotation（基于过滤的注释）
ANNOVAR简介
ANNOVAR是由王凯编写的一个注释软件，可以对SNP和indel进行注释，也可以进行变异的过滤筛选。
ANNOVAR能够利用最新的数据来分析各种基因组中的遗传变异。主要包含三种不同的注释方法，Gene-based Annotation（基于基因的注释）、Region-based Annotation（基于区域的注释）、Filter-based Annotation（基于筛选的注释）。
ANNOVAR由Perl编写。
优点：提供多个数据可直接下载、支持多种格式、注释直观；
缺点：没有数据库的物种无法注释。
ANNOVAR结构
ANNOVAR
│ annotate_variation.pl #主程序，功能包括下载数据库，三种不同的注释
│ coding_change.pl #可用来推断蛋白质序列
│ convert2annovar.pl #将多种格式转为.avinput的程序
│ retrieve_seq_from_fasta.pl #用于自行建立其他物种的转录本
│ table_annovar.pl #注释程序，可一次性完成三种类型的注释
│ variants_reduction.pl #可用来更灵活地定制过滤注释流程
│
├─example #存放示例文件
│
└─humandb #人类注释数据库ANNOVAR下载数据库
命令示例
[kaiwang@biocluster ~/]$ Perl annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb -webfrom annovar refGene humandb/
# -buildver 表示version
# -downdb 下载数据库的指令
# -webfrom annovar 从annovar提供的镜像下载，不加此参数将寻找数据库本身的源
# humandb/ 存放于humandb/目录下
ANNOVAR的官方文档列出了可供下载的数据库及版本、更新日期等信息，可用-downdb avdblist参数查看。
ANNOVAR输入格式
[kaiwang@biocluster ~/]$ cat example/ex1.avinput
1 948921 948921 T C comments: rs15842, a SNP in 5' UTR of ISG15
1 1404001 1404001 G T comments: rs149123833, a SNP in 3' UTR of ATAD3C
1 5935162 5935162 A T comments: rs1287637, a splice site variant in NPHP4
1 162736463 162736463 C T comments: rs1000050, a SNP in Illumina SNP arrays
1 84875173 84875173 C T comments: rs6576700 or SNP_A-1780419, a SNP in Affymetrix SNP arrays
1 13211293 13211294 TC - comments: rs59770105, a 2-bp deletion
1 11403596 11403596 - AT comments: rs35561142, a 2-bp insertion
1 105492231 105492231 A ATAAA comments: rs10552169, a block substitution
1 67705958 67705958 G A comments: rs11209026 (R381Q), a SNP in IL23R associated with Crohn's disease
2 234183368 234183368 A G comments: rs2241880 (T300A), a SNP in the ATG16L1 associated with Crohn's disease
16 50745926 50745926 C T comments: rs2066844 (R702W), a non-synonymous SNP in NOD2
16 50756540 50756540 G C comments: rs2066845 (G908R), a non-synonymous SNP in NOD2
16 50763778 50763778 - C comments: rs2066847 (c.3016_3017insC), a frameshift SNP in NOD2
13 20763686 20763686 G - comments: rs1801002 (del35G), a frameshift mutation in GJB2, associated with hearing loss
13 20797176 21105944 0 - comments: a 342kb deletion encompassing GJB6, associated with hearing loss
ANNOVAR使用.avinput格式，如以上代码所示，该格式每列以tab分割，最重要的地方为前5列，分别是
染色体(Chromosome)
起始位置(Start)
结束位置(End)
参考等位基因(Reference Allele)
替代等位基因(Alternative Allele)
剩下为注释部分（可选）。
ANNOVAR主要也是依靠这5处信息对数据库进行比对，进而注释变异。
ANNOVAR格式转换
命令示例
$ convert2annovar.pl -format vcf4 example/ex2.vcf > ex2.avinput
# -format vcf4 指定格式为vcf
ANNOVAR主要使用convert2annovar.pl程序进行转换，转换后文件是精简过的，主要包含前面提到的5列内容，如果要将原格式的文件的所有内容都包含在转换后的.avinput文件中，可以使用-includeinfo参数；如果需要分开每个sample输出单一的.avinput文件，可以使用-allsample参数，等等。
ANNOVAR还主要支持以下格式转换：
SAMtools pileup format
Complete Genomics format
GFF3-SOLiD calling format
SOAPsnp calling format
MAQ calling format
CASAVA calling format
ANNOVAR注释功能
用table_annovar.pl进行注释（可一次性完成三种类型的注释）
命令示例
[kaiwang@biocluster ~/]$ table_annovar.pl example/ex1.avinput humandb/ -buildver hg19 -out myanno -remove -protocol refGene,cytoBand,genomicSuperDups,esp6500siv2_all,1000g2014oct_all,1000g2014oct_afr,1000g2014oct_eas,1000g2014oct_eur,snp138,ljb26_all -operation g,r,r,f,f,f,f,f,f,f -nastring . -csvout
# -buildver hg19 表示使用hg19版本
# -out myanno 表示输出文件的前缀为myanno
# -remove 表示删除注释过程中的临时文件
# -protocol 表示注释使用的数据库，用逗号隔开，且要注意顺序
# -operation 表示对应顺序的数据库的类型（g代表gene-based、r代表region-based、f代表filter-based），用逗号隔开，注意顺序
# -nastring . 表示用点号替代缺省的值
# -csvout 表示最后输出.csv文件
输出的csv文件将包含输入的5列主要信息以及各个数据库里的注释，此外，table_annoval.pl可以直接对vcf文件进行注释（不需要转换格式），注释的内容将会放在vcf文件的“INFO”那一栏。
Gene-based Annotation(基于基因的注释)
基于基因的注释（gene-based annotation）揭示variant与已知基因直接的关系以及对其产生的功能性影响，需要使用for gene-based的数据库。
命令示例
[kaiwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -geneanno -dbtype refGene -out ex1 -build hg19 example/ex1.avinput humandb/
# -geneanno 表示使用基于基因的注释
# -dbtype refGene 表示使用"refGene"数据库
# -out ex1 表示输出文件以ex1为前缀
因为annotate_variation.pl默认使用gene-based注释类型以及refGene数据库，所以上面的命令可以缺省-geneanno -dbtype refGene。
运行命令后将会生成3个文件：
ex1.variant_function 注释所有变异所在基因及位置
ex1.exonic_variant_function 详细注释外显子区域的变异功能、类型、氨基酸改变等
ex1.ann.log log文件，包含运行的命令行及运行提示，所用数据库文件
ex1.variant_function
第一个文件以.variant_function结尾，主要的内容如下
[kaiwang@biocluster ~/]$ cat ex1.variant_function
UTR5 ISG15(NM_005101:c.-33T>C) 1 948921 948921 T C comments: rs15842, a SNP in 5' UTR of ISG15
UTR3 ATAD3C(NM_001039211:c.*91G>T) 1 1404001 1404001 G T comments: rs149123833, a SNP in 3' UTR of ATAD3C
splicing NPHP4(NM_001291593:exon19:c.1279-2T>A,NM_001291594:exon18:c.1282-2T>A,NM_015102:exon22:c.2818-2T>A) 1 5935162 5935162 A T comments: rs1287637, a splice site variant in NPHP4
intronic DDR2 1 162736463 162736463 C T comments: rs1000050, a SNP in Illumina SNP arrays
intronic DNASE2B 1 84875173 84875173 C T comments: rs6576700 or SNP_A-1780419, a SNP in Affymetrix SNP arrays
intergenic LOC645354(dist=11566),LOC391003(dist=116902) 1 13211293 13211294 TC - comments: rs59770105, a 2-bp deletion
intergenic UBIAD1(dist=55105),PTCHD2(dist=135699) 1 11403596 11403596 - AT comments: rs35561142, a 2-bp insertion
intergenic LOC100129138(dist=872538),NONE(dist=NONE) 1 105492231 105492231 A ATAAA comments: rs10552169, a block substitution
exonic IL23R 1 67705958 67705958 G A comments: rs11209026 (R381Q), a SNP in IL23R associated with Crohn's disease
exonic ATG16L1 2 234183368 234183368 A G comments: rs2241880 (T300A), a SNP in the ATG16L1 associated with Crohn's disease
exonic NOD2 16 50745926 50745926 C T comments: rs2066844 (R702W), a non-synonymous SNP in NOD2
exonic NOD2 16 50756540 50756540 G C comments: rs2066845 (G908R), a non-synonymous SNP in NOD2
exonic NOD2 16 50763778 50763778 - C comments: rs2066847 (c.3016_3017insC), a frameshift SNP in NOD2
exonic GJB2 13 20763686 20763686 G - comments: rs1801002 (del35G), a frameshift mutation in GJB2, associated with hearing loss
exonic CRYL1,GJB6 13 20797176 21105944 0 - comments: a 342kb deletion encompassing GJB6, associated with hearing loss
注释后输出的文件，同样每列以tab分割，第1列为变异所在的类型，如外显子（exonic）、UTR5、UTR3等（官方文档有详细的类型列表）。
如果第1列的为外显子、内含子或者非编码RNA，第二行将是对应的基因名（有多个基因名则会以逗号隔开）；否则第二列将会给出相邻的两个基因以及对应的距离。
从第3列开始至第7列为输入的那5列主要信息，剩余为注释信息。
需要注意的是，如果该变异找到多种注释，ANNOVAR将会对它进行比较，以exonic = splicing > ncRNA > UTR5/UTR3 > intron > upstream/downstream > intergenic 的优先权重，取最优的表示，如果你想ANNOVAR列出该变异所有注释，可以使用--separate参数。
ex1.exonic_variant_function
第二个输出文件以.exonic_variant_function结尾，只列出外显子（氨基酸会改变）的变异，主要内容如下
[kaiwang@biocluster ~/]$ cat ex1.exonic_variant_function
line9 nonsynonymous SNV IL23R:NM_144701:exon9:c.G1142A:p.R381Q, 1 67705958 67705958 G A comments: rs11209026 (R381Q), a SNP in IL23R associated with Crohn's disease
line10 nonsynonymous SNV ATG16L1:NM_001190267:exon9:c.A550G:p.T184A,ATG16L1:NM_017974:exon8:c.A841G:p.T281A,ATG16L1:NM_001190266:exon9:c.A646G:p.T216A,ATG16L1:NM_030803:exon9:c.A898G:p.T300A,ATG16L1:NM_198890:exon5:c.A409G:p.T137A, 2 234183368 234183368 A G comments: rs2241880 (T300A), a SNP in the ATG16L1 associated with Crohn's disease
line11 nonsynonymous SNV NOD2:NM_022162:exon4:c.C2104T:p.R702W,NOD2:NM_001293557:exon3:c.C2023T:p.R675W, 16 50745926 50745926 C comments: rs2066844 (R702W), a non-synonymous SNP in NOD2
line12 nonsynonymous SNV NOD2:NM_022162:exon8:c.G2722C:p.G908R,NOD2:NM_001293557:exon7:c.G2641C:p.G881R, 16 50756540 50756540 G comments: rs2066845 (G908R), a non-synonymous SNP in NOD2
line13 frameshift insertion NOD2:NM_022162:exon11:c.3017dupC:p.A1006fs,NOD2:NM_001293557:exon10:c.2936dupC:p.A979fs, 16 50763778 5076377comments: rs2066847 (c.3016_3017insC), a frameshift SNP in NOD2
line14 frameshift deletion GJB2:NM_004004:exon2:c.35delG:p.G12fs, 13 20763686 20763686 G - comments: rs1801002 (del35G), a frameshift mutation in GJB2, associated with hearing loss
line15 frameshift deletion GJB6:NM_001110221:wholegene,GJB6:NM_001110220:wholegene,GJB6:NM_001110219:wholegene,CRYL1:NM_015974:wholegene,GJB6:NM_006783:wholegene, 13 20797176 21105944 0 - comments: a 342kb deletion encompassing GJB6, associated with hearing loss
该文件的第1列为.variant_function文件中该变异所在的行号；第2列为该变异的功能性后果，如非同义SNV、同义SNV、移码插入等（官方文档同样有详细的类型列表）；第3列包括基因名称、转录识别标志和相应的转录本的序列变化。第四列开始为输入文件的内容。
Region-based Annotation（基于区域的注释）
基于过滤的注释精确匹配查询变异与数据库中的记录：如果它们有相同的染色体，起始位置，结束位置，REF的等位基因和ALT的等位基因，才能认为匹配。基于区域的注释看起来更像一个区域的查询（这个区域也可以是一个单一的位点），在一个数据库中，它不在乎位置的精确匹配，它不在乎核苷酸的识别。
基于区域的注释（region-based annotation）揭示variant与不同基因组特定段的关系，例如：它是否落在已知的保守基因组区域。基于区域的注释的数据库一般由UCSC提供。
命令示例
[kaiwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -regionanno -build hg19 -out ex1 -dbtype phastConsElements46way example/ex1.avinput humandb/
# -regionanno 表示使用基于区域的注释
# -dbtype phastConsElements46way 表示使用"phastConsElements46way"数据库，注意需要使用Region-based的数据库
输出文件是ex1.hg19_phastConsElements46way，可以看到，Region-based 注释将会生成以注释数据库为后缀的注释文件。该文件主要内容有
[kaiwang@biocluster ~/]$ cat ex1.hg19_phastConsElements46way
phastConsElements46way Score=387;Name=lod=50 1 67705958 67705958 G A comments: rs11209026 (R381Q), a SNP in IL23R associated with Crohn's disease
phastConsElements46way Score=420;Name=lod=68 16 50756540 50756540 G C comments: rs2066845 (G908R), a non-synonymous SNP in NOD2
phastConsElements46way Score=385;Name=lod=49 16 50763778 50763778 - C comments: rs2066847 (c.3016_3017insC), a frameshift SNP in NOD2
phastConsElements46way Score=395;Name=lod=54 13 20763686 20763686 G - comments: rs1801002 (del35G), a frameshift mutation in GJB2, associated with hearing loss
phastConsElements46way Score=545;Name=lod=218 13 20797176 21105944 0 - comments: a 342kb deletion encompassing GJB6, associated with hearing loss
输出的注释文件第1列为“phastConsElements46way”，对应注释的类型，这里的phastCons 46-way alignments属于保守的基因组区域的注释；第二列包含评分和名称，评分来自UCSC，可以使用--score_threshold和--normscore_threshold来过滤评分低的变异，“Name=lod=x”名称表示该区域的名称；剩余的部分为输入文件的内容。
Filter-based Annotation（基于过滤的注释）
filter-based和region-based主要的区别是，filter-based针对mutation（核苷酸的变化）而region-based针对染色体上的位置。例如region-based比对chr1:1000-1000而filter-based比对chr1:1000-1000上的A->G。
基于过滤的注释，使用不同的过滤数据库，可以给出这个variant的一系列信息。如在全基因组数据中的变异频率，可使用1000g2015aug、kaviar_20150923等数据库；在全外显组数据中的变异频率，可使用exac03、esp6500siv2等；在孤立的或者低代表人群中的变异频率，可使用ajews等数据库。（在ANNOVAR官方文档中也有详细的介绍）
命令示例
[kaiwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -filter -dbtype 1000g2012apr_eur -buildver hg19 -out ex1 example/ex1.avinput humandb/
# -filter 使用基于过滤的注释
# -dbtype 1000g2012apr_eur 使用"1000g2012apr_eur"数据库运行命令后，已知的变异会被写入一个*dropped结尾的文件，而没有在数据库中找到的变异将会被写入*filtered结尾的文件，*dropped文件是我们所需要的结果。这个文件内容如下
[kaiwang@biocluster ~/]$ cat ex1.hg19_EUR.sites.2012_04_dropped
1000g2012apr_eur 0.04 1 1404001 1404001 G T comments: rs149123833, a SNP in 3' UTR of ATAD3C
1000g2012apr_eur 0.87 1 162736463 162736463 C T comments: rs1000050, a SNP in Illumina SNP arrays
1000g2012apr_eur 0.81 1 5935162 5935162 A T comments: rs1287637, a splice site variant in NPHP4
1000g2012apr_eur 0.06 1 67705958 67705958 G A comments: rs11209026 (R381Q), a SNP in IL23R associated with Crohn's disease
1000g2012apr_eur 0.54 1 84875173 84875173 C T comments: rs6576700 or SNP_A-1780419, a SNP in Affymetrix SNP arrays
1000g2012apr_eur 0.96 1 948921 948921 T C comments: rs15842, a SNP in 5' UTR of ISG15
1000g2012apr_eur 0.05 16 50745926 50745926 C T comments: rs2066844 (R702W), a non-synonymous SNP in NOD2
1000g2012apr_eur 0.01 16 50756540 50756540 G C comments: rs2066845 (G908R), a non-synonymous SNP in NOD2
1000g2012apr_eur 0.01 16 50763778 50763778 - C comments: rs2066847 (c.3016_3017insC), a frameshift SNP in NOD2
1000g2012apr_eur 0.53 2 234183368 234183368 A G comments: rs2241880 (T300A), a SNP in the ATG16L1 associated with Crohn's disease*dropped文件第1列如region-based注释的结果一样以数据库命名；第二列为等位基因频率，我们可以用-maf 0.05参数来过滤掉低于0.05的变异，；第三列开始同样是输入文件的内容。
需要注意的是，我们也可以使用-maf 0.05 -reverse过滤掉高于0.05的变异；但是过滤ALT等位基因的频率，我们更提倡使用-score_threshold参数。
ANNOVAR其他程序
ANNOVAR包里还有
Variants_Reduction: prioritizing causal variants
Coding_Change: Infer mutated protein sequence
Retrieve_Seq_from_FASTA: Retrieve nucleotide/protein sequences
三个程序没有介绍，可以参考官方文档的Accessory Programs自行了解。
参考文献：
Wang K, Li M, Hakonarson H. ANNOVAR: Functional annotation of genetic variants from next-generation sequencing data Nucleic Acids Research, 38:e164, 2010
ANNOVAR Documentation
annovar对人类基因组和非人类基因组variants注释流程