生物 分子网络构建基础——酶动力学

0. 引言
1. Michaelis-Menten法则
2. 模型改进（可逆的催化反应）
3. 参数意义
4. $K_m$ 与 $K_{cat}$ 的区别
5. Hill公式
6. Species-Reaction(SR) Graph简介
7.参考资料

很多生物化学反应是有酶参与的，因此在建立酶动力学模型的时候需要做一些调整。

酶（enzyme）是催化剂（catalysts，通常是蛋白质），其作用是帮助底物（substrates）转换为产物（products），并且在此过程中，它们自身没有改变。它们的重要特征是：①催化动力（catalytic power）、②特异性（specificity）和③调控（regulation）。

酶动力学是研究酶结合底物能力和催化反应速率的科学。研究者通过酶反应分析法（enzyme assay）来获得用于酶动力学分析的反应速率数据。

0. 引言

$v0=Vmax[S]Km+[S]v_0=frac{V_{max}[S]}{K_m+[S]}$ 称为Minchaelis-Menten方程，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的，其中 $K_m$ 称为米氏常数， $V_{max}$ 是酶在底物饱和时的最大反应速度， $[S]$ 为底物浓度。如下图所示：

$K_m$ 值的物理意义为反应速度V达到 $12Vmaxfrac{1}{2}V_{max}$ 时的底物浓度（即 $K_m=[S]$ ），一般情况下单位是 $m o l / L$ ，该值与酶的浓度无关，是由酶的性质决定，可用于鉴别不同的酶。

1. Michaelis-Menten法则

1913年Michaelis L.和Menten M.根据中间复合体学说提出了单底物酶促反应的快速平衡模型或平衡态模型（equilibrium-state model），也称为米-曼氏模型（Michaelis-Menten model）。在此模型中，酶E把底物S经过两步转换成产物P。首先E和S结合，产生复合物C，然后C分解，产生P，并释放E，这个模型可以描述成：
$S+E⇌k−1k1C→k2P+ES+Eoverset{k_1}{underset{k_{-1}}rightleftharpoons}Coverset{k_2}{rightarrow}P+E$
一般地，P和E也是可以反过去合成C，但是如果在实践问题中，P会被很快连续地移除，那么就可以有效地阻止这个可逆反应。

基于质量作用定于，我们可以描述各个物质的改变率：
$d[S]dt=k−1[C]−k1[S][E]d[E]dt=(k−1+k2)[C]−l1[S][E]d[C]dt=k1[S][E]−(k2+k−1)[C]d[P]dt=k2[C]frac{d[S]}{dt}=k_{-1}[C]-k_1[S][E] \ frac{d[E]}{dt}=(k_{-1}+k_2)[C]-l_1[S][E] \ frac{d[C]}{dt}=k_1[S][E]-(k_2+k_{-1})[C] \ frac{d[P]}{dt}=k_2[C]\$
注意，在反应中，由于催化剂的总量（包括自由的E和结合了S后称为C）保持不变，从而 $E]+[C]=[E_Tot]$ 为常数，即应该有 $d[E]dt+d[C]dt=0frac{d[E]}{dt}+frac{d[C]}{dt}=0$ 。

由于催化剂的存在大大加速了反应速度，因而可以认为很快达到平衡态，为此Michealis-Menten采用了一种平衡态近似（equilibrium approximation）的方法分析这个过程： $d[S]dt=0frac{d[S]}{dt}=0$ ，即 $k_1[S][E]=k_{-1}[C]$ ，此种方法有一定缺陷。1925年，Briggs和Haldan提出了一种更为合理的方法，即平衡态近似，假定 $d[C]dt=0frac{d[C]}{dt}=0$ 。目前主要使用的式后者的平衡态方程，但仍然称为Michaelis-Menten法则：

由于假定了 $d[C]dt=0frac{d[C]}{dt}=0$ ，所以有 $k_1[S][E]=(k_2+k_{-1})[C]$ ，利用 $E]+[C]=[E_{Tot}]$ ，可以推导出：
$[C]=[ETot][S][S]+KM[C]=frac{[E_{Tot}][S]}{[S]+K_M}$
式中， $Km=k−1+k2k1K_m=frac{k_{-1}+k_2}{k_1}$ 。而 $d[P]dt=k2[C]frac{d[P]}{dt}=k_2[C]$ ，记 $V$ 为整个反应过程式（1）中产物P的生成速率，它与底物S的关系为：
$V=d[p]dt=k2[C]=k2[ETot][S][S]+Km=Vmax[S][S]+KmV=frac{d[p]}{dt}=k_2[C]=frac{k_2[E_{Tot}][S]}{[S]+K_m}=frac{V_{max}[S]}{[S]+K_m}$
式中， $V_{max}=k_2[E_{Tot}]$ ，这样就得到了产物和底物的关系。

显然，Michaelis-Mentern法则是在催化反应的情况下，按照质量作用定律的近似得到的，但仍然是一个有用的近似。

一般来说，实验中 $k_1、k_{-1}、k_2$ 等反应率很难测定，但我们可能相对容易直接测定到 $K_m$ 与 $V_{max}$ ，因为式（4）可以改写成：
$1V=1Vmax+KmVmax1[S]frac{1}{V}=frac{1}{V_{max}}+frac{K_m}{V_{max}}frac{1}{[S]}$
换而言之， $1Vfrac{1}{V}$ 是 $1[S]frac{1}{[S]}$ 的线性函数，所以通过实验得到[S]和V，然后通过 $1Vfrac{1}{V}$ 和 $1[S]frac {1}{[S]}$ 的线性关系斜率和截距可以得到 $V_{max}$ 和 $K_m$ 。

从式（4）可以看到，Michaelis-Menten法则有两种特殊形式：

当底物浓度较低时，分母接近于 $K_m$ 速率近似为线性，正比于催化剂总量 $E_{Tot}]$ ，称为一级反应；
当底物浓度很高时， $[S]Km+[S]frac{[S]}{K_m+[S]}$ 会饱和到1，而速率近似到最大速率 $V_{max}$ ，并且基本与 $[S]$ 浓度无关，称为零级反应。

第二种推导过程（看起来比较专业）：

首先，给定一个反应方程：
$E+S↔KsES→kcatP+EE+Soverset{K_s}{leftrightarrow}ESoverset{k_{cat}}{rightarrow }P+E$
式中， $E$ 是酶， $S$ 是底物， $E S$ 是中间复合体， $P$ 是产物， $K_s$ 是[ES]的解离[平衡]常数，即第一步的逆向反应中速率常数 $k_{-1}$ 和正向反应速率常数 $k_1$ 之比 $k−1k1frac{k_{-1}}{k_1}$ ， $k_{cat}$ 是催化常数，即第二步中的向前速率常数 $k_2$ 。

模型假设

假设反应中只有一个中间复合体，反应的第一步 $E+S↔KsESE+Soverset{K_s}{leftrightarrow}ES$ 是可逆反应，并始终保持；
反应的第二步 $ES→kcatP+EESoverset{k_{cat}}{rightarrow }P+E$ 是限速步骤，即 $k−1≫k2k_{-1}gg k_2$ ，也就是说 $E S$ 分解生成 $P$ 的速率不足以破坏 $E$ 和 $E S$ 之间的快速平衡;
为了达到平衡，只用初始底物浓度 $S_0]$ 的很小一部分，因为一般情况下 $[S0]≫[E0][S_0]gg [E_0]$ （初始酶溶度），因此在反应的初期，底物浓度[S]可以用 $S_0]$ 代替，或者把 $[S]$ 看作 $S_0]$ ；
酶在反应中不被消耗，只是或以游离形式 $E$ 存在或以结合形式 $E S$ 存在，因此游离酶浓度 $[E]$ 和中间复合体浓度 $[E S]$ 只和等于初始酶浓度 $E_0]$ 或总酶浓度 $E_t]$ ，即 $E]+[ES]=[E_0]=[E_t]$ ，这就是所谓的酶守恒公式（conservation equation of enzyme）；
该模型没有考虑 $P+E→k−2ESP+Eoverset{k_{-2}}{rightarrow}ES$ 这一逆反应，但显然 $k_{-2}$ 是一个不等于零的常数，但是为简要分析，我们忽略这一步，因此这一时期的米氏方程仅适用于反应的初速率。

推导过程

根据平衡态模型 $S$ 转变成 $P$ 的总速率应由限速反应（模型中第二步）决定，因此产物生成速率：
$v_0=k_{cat}[ES]$
$E S$ 复合体的浓度 $[E S]$ 在实验上不易测定，需要找出容易测定的其他参数（如某些常数和已知的 $S_0]$ 等）来代替它。为此利用第一步反应（快速平衡）中 $E S$ 解离成 $E$ 和 $S$ 的解离常数:
$Ks=k−1k1=[E][S][ES]K_s=frac{k_{-1}}{k_1}=frac{[E][S]}{[ES]}$
则：
$[ES]=[E][S]KS[ES]=frac{[E][S]}{K_S}$
将酶守恒公式 $E]=[E_t]-[ES]$ 代入上式得:
$[ES]=([Et]−[ES])[S]KS[ES]=frac{([E_t]-[ES])[S]}{K_S}$
经整理得：
$[ES]=[Et][S]Ks+[S][ES]=frac{[E_t][S]}{K_s+[S]}$
带入 $v_0=k_{cat}[ES]$ ，得：
$v0=kcat[Et][S]Ks+[S]v_0=frac{k_{cat}[E_t][S]}{K_s+[S]}$
这里 $k_{cat}[E_t]$ 具有特殊的意义。当底物浓度[S]高至使所有酶分子都被饱和时，则 $ES]=[E_t]$ ，反应初速率 $v_0$ 将达到最大值， $V_{max}$ 可表示为：
$lim⁡[S]→∞v0=kcat[Et][S]Ks+[S]=kcat[Et]=Vmaxlim_{[S] to infty}{v_0}=frac{k_{cat}[E_t][S]}{K_s+[S]}=k_{cat}[E_t]=V_{max}$
因此， $v0=kcat[Et][S]Ks+[S]v_0=frac{k_{cat}[E_t][S]}{K_s+[S]}$ 也可以写成：
$v0=Vmax[S]Ks+[S]Δv_0=frac{V_{max}[S]}{K_s+[S]}Delta$
参考资料：Michaelis-Menten Kinetics and Briggs-Haldane Kinetics

2. 模型改进（可逆的催化反应）

1925年Briggs G. E.和Haldane J. B. S.对该模型提出了修正，但仍保留米-曼氏假设的后三点。他们用稳态模型（steady-state model）或称Briggs-Haldane氏模型：
$E+S↔k1/k−1ES↔k2/k−2P+EE+Soverset{k_1/k_{-1}}{leftrightarrow}ESoverset{k_2/k_{-2}}{leftrightarrow }P+E$
式中， $k_{-2}$ 代替了平衡态模型，当反应进行到稳态时，系统中 $[E S]$ 由零增加到一定值，在一定时间内虽然 $[S]$ 和 $[P]$ 在不断变化， $E S$ 复合体也在不断地生成和分解，但 $E S$ 的生成速率 $v_f$ 与分解速率 $v_d$ 接近相等， $[E S]$ 基本保持不变。因此在稳态下 $E S$ 形成的净速率:
$d[ES]dt=vf−vd=0frac{d[ES]}{dt}=v_f-v_d=0$
同时 $E_t]=[E]+[ES]$ ， $v_f=k_1([E_t]-[ES])[S]$ ，且 $v_d=k_{-1}[ES]+k_2[ES]=(k_{-1}+k_2)[ES]$ ，所以 $k_1([E_t]-[ES][S])=(k_{-1}+k_2)[ES]$ ，整理后得到：
$([Et]−[ES])[S][ES]=(k−1+k2)k1frac{([E_t]-[ES])[S]}{[ES]}=frac{(k_{-1}+k_2)}{k_1}$
，这里，速率是常数之比，即 $(k−1+k2)k1frac{(k_{-1}+k_2)}{k_1}$ ，将其定义为米氏常数(Michaelis constant)， $K_m$ ：
$Km=k−1+k2k1K_m=frac{k_{-1}+k_2}{k_1}$
将 $K_m$ 带入式（17）中，整理得到：
$ES=[Et][S]Km+[S]ES=frac{[E_t][S]}{K_m+[S]}$
根据稳态模型，S转换为P的速率决定于稳态浓度[ES]和限速的速率常数 $k_2$ ，因此
$v_0=k_2[ES]=k_{cat}[ES]$
将式（19）带入上式，得到：
$v0=kcat[Et][S]Km+[S]v_0=frac{k_{cat}[E_t][S]}{K_m+[S]}$
或
$v0=Vmax[S]Km+[S]Δv_0=frac{V_{max}[S]}{K_m+[S]}Delta$

根据两种模型推导出的速率方程形式上是一样的，两者不同的是 $K_m$ 比 $K_s$ 具有更大的普遍性。稳态下，当 $k−1≫k2k_{-1} gg k_2$ 时，则 $Km=k−1k1K_m=frac{k_{-1}}{k_1}$ ，因此可以把平衡态看成是稳态的一个特例。

另一种更简化的方法如下：
$E+S↔k1/k−1ES↔k2/k−2P+EE+Soverset{k_1/k_{-1}}{leftrightarrow}ESoverset{k_2/k_{-2}}{leftrightarrow }P+E$
式中， $E_t]=[E]+[ES]$ 为催化剂的总量，作为平衡态近似，即 $d[ES]dt=0frac{d[ES]}{dt}=0$ ，得到：
$[ES]=[Et](k1[S]+k−2[P])k1[S]+k−2[p]+k−1+k2[ES]=frac{[E_t](k_1[S]+k_{-2}[P])}{k_1[S]+k_{-2}[p]+k_{-1}+k_2}$
将其带入 $V=d[P]dt=k2[ES]−k−2[P][E]V=frac{d[P]}{dt}=k_2[ES]-k_{-2}[P][E]$ .得：
$V=[Et]k1k2[S]−k−1k−2[P]k1[S]+k−2[p]+k−1+k2V=[E_t]frac{k_1k_2[S]-k_{-1}k_{-2}[P]}{k_1[S]+k_{-2}[p]+k_{-1}+k_2}$
当[P]比较小趋近于零得时候，就趋近于单项得MM公式。

3. 参数意义

当 $V=12VmaxV=frac{1}{2}V_{max}$ 时， $K_m=[S]$ 。因此， $K_m$ 等于酶促反应速度最大值一半时的底物浓度。
当 $k−1≫k2k_{-1} gg k_2$ 时， $Km=k−1k1=KsK_m= frac{k_{-1}}{k_1}=K_s$ 。因此， $K_m$ 可以反映酶与底物亲和力的大小，即 $K_m$ 值越小，则酶与底物的亲和力越大。
$K_m$ 可用于判断反应级数，当 $S]<0.01K_m$ 时， $v=VmaxKm[S]v=frac{V_{max}}{K_m}[S]$ ，反应为一级反应，即反应速度与底物浓度成正比，当 $S]>100K_m$ 时， $v=V_{max}$ ，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；当 $0.01K_m<[S]<100K_m$ 时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应。
$K_m$ 是酶的特征性常数；在一定条件下，某种酶的 $K_m$ 值是恒定的，因而可以通过测定不同酶(特别是一组同工酶)的 $K_m$ 值，来判断是否为不同的酶。
$K_m$ 可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时， $K_m$ 值最小者，为该酶的最适底物。
$K_m$ 可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当 $S]=10K_m$ 时， $v=91v=91%V_{max}$ ，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。
$V_{max}$ 可用于酶的转换数（turnover number）的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转换为产物的分子数。
$K_m$ 和 $V_{max}$ ：主要采用Lineweaver-Burk[双倒数作图法]和Hanes作图法。

Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。将米氏方程两侧同取倒数，即可得到

$1V=1Vmax+KmVmax1[S]frac{1}{V}=frac{1}{V_{max}}+frac{K_m}{V_{max}}frac{1}{[S]}$

这是一个很为常用的作图方法，可以直观地算出Km和Vmax值，但是误差较大。

Eadie-Hofstee作图法，将米氏方程改写成

$v=Vmax−Kmv[S]v=V_{max}-K_mfrac{v}{[S]}$

Hanes-Woolf作图法，将Lineweaver-Burk方程两边同时乘上 $[S]$ 可以得到:

$[S]v=KmVmax+[S]Vmaxfrac{[S]}{v}=frac{K_m}{V_{max}}+frac{[S]}{V_{max}}$

参考资料：https://www.sciencedirect.com/topics/engineering/michaelis-menten-equation

4. $K_m$ 与 $K_{cat}$ 的区别

$K_m$ 是米氏常数（Michaelis constant），是酶与底物之间亲和力（affinity）的大小（这里指遵循米氏方程的酶）。 $K_m$ 等于酶促反应为最大反应速率一半时的底物浓度，其单位是mol/L，因此 $K_m$ 越小，表明酶进行反应所需的底物浓度越低，也可以说酶与底物之间亲和力越大。 $K_m$ 是一个常数，当pH，温度，离子强度不变时，Km是恒定的。
$K_{cat}$ 又叫转化数（turnover number），利用 $V_max$ 除以酶浓度进行计算，所以可以知道， $K_{cat}$ 衡量的是在最有优条件下酶催化生成底物的速率。此时反应速率最大（ $V_{max}$ ），酶的活性位点已经被底物完全饱和。 $K_{cat}$ 是一个常数，其单位是1/s，也可以将 $K_{cat}$ 理解成单个酶分子在一秒内转化底物的数量，或者单个酶分子转换一个底物分子所需的时间，因此 $K_{cat}$ 也叫做转化数。
$KcatKmfrac{K_{cat}}{K_m}$ ，两个常数的比，当然也是一个常数。 $K_{cat}$ 与 $K_m$ 的比是衡量一个酶催化效率的最重要参数。 $K_{cat}$ 越大， $K_m$ 越小，二者的比值越大。 $K_{cat}$ 越大说明酶转化底物的速率越快， $K_m$ 越小说明酶与底物之间亲和力越大。当酶有多个可利用的底物时，其对不同底物的催化效率可能差别很大。就可以用来确定 $KcatKmfrac{K_{cat}}{K_m}$ 酶的最适底物，同一个酶对不同底物的 $KcatKmfrac{K_{cat}}{K_m}$ 最大可相差100万倍。

5. Hill公式

在描述生化反应的数学模型中常常出现Hill公式：
$xnxn+cn,(n>0)frac{x^n}{x^n+c^n}, (n>0)$
上述MM法则得到的 $V=Vmax[S][S]+KmV=frac{V_{max}[S]}{[S]+K_m}$ 就是Hill公式中n=1的一种特例。

这里我们以协调关系（cooperativity）为例进行说明。考虑一下典型催化协调作用。假定一种催化剂有两种分子形式可以和底物结合，即催化剂E可以和底物S结合，称为复合物 $C_1$ ，而复合物 $C_1$ 也有催化作用，可以和S结合成复合物 $C_2$ 。它们的化学反应可以表示为：
$S+E⇌k−1k1C1→k2E+PS+C1⇌k−3k3C2→k4C1+PS+Eoverset{k_1}{underset{k_{-1}}rightleftharpoons}C_1overset{k_2}{rightarrow}E+P \ S+C_1overset{k_3}{underset{k_{-3}}rightleftharpoons}C_2overset{k_4}{rightarrow}C_1+P$
对于式（30），可以写出相应的反应方程组：
$d[S]dt=−k1[S][E]+k−1[C1]−k3[S][C1]+k−3[C2]d[C1]dt=k1[S][E]−(k−1+k2)[C1]−k3[S][C1]+(k4+k−3)[C2]d[C2]dt=k3[S][C1]−(k4+k−3)[C2]frac{d[S]}{dt}=-k_1[S][E]+k_{-1}[C_1]-k_3[S][C_1]+k_{-3}[C_2] \ frac{d[C_1]}{dt}=k_1[S][E]-(k_{-1}+k_2)[C_1]-k_3[S][C_1]+(k_4+k_{-3})[C_2] \ frac{d[C_2]}{dt}=k_3[S][C_1]-(k_4+k_{-3})[C_2]$
式中， $E]+[C_1]+[C_2]=[E_{Tot}]$ 为催化剂各种形式的总量。然后对 $C_1]$ 和 $C_2]$ 做平衡态近似假设： $d[C1]dt=d[C2]dt=0frac{d[C_1]}{dt}=frac{d[C_2]}{dt}=0$ ，从而得到 $C_1]$ 和 $C_2]$ 平衡态：
$[C1]=K2[ETot][S]K1K2+K2[S]+[S]2[C2]=[ETot[S]2]K1K2+K2[S]+[S]2[C_1]=frac{K_2[E_{Tot}][S]}{K_1K_2+K_2[S]+[S]^2} \ [C_2]=frac{[E_{Tot}[S]^2]}{K_1K_2+K_2[S]+[S]^2}$
式中， $K1=k−1+k2k1K_1=frac{k_{-1}+k_2}{k_1}$ ； $K2=k4+k−3k3K_2=frac{k_4+k_{-3}}{k_3}$ 。从而反应速率V为：
$V=k2[C1]+k4[C2]=(k2K2+k4[S])[ETot[S]]K1K2+K2[S]+[S]2V=k_2[C_1]+k_4[C_2]=frac{(k_2K_2+k_4[S])[E_{Tot}[S]]}{K_1K_2+K_2[S]+[S]^2}$
考虑式（30）是一个极端情况：从 $C_1$ 产生P的速率非常慢，绝大部分P都是从 $C_2$ 产生的，即 $k1→0,k3→∞k_1rightarrow 0,k_3rightarrow infty$ ，且 $k_1k_3$ 是常数。这时 $K2→0,K1→∞K_2rightarrow 0,K_1rightarrow infty$ ，而 $K1K2=k−1+k2k1k−3+k4k3K_1K_2=frac{k_{-1}+k_2}{k_1}frac{k_{-3}+k_4}{k_3}$ 也趋于常数时，于是在这种极端情况下有：
$V=k4[ETot][S]2Km2+[S]2=Vmax[S]2Km2+[S]2V=frac{k_4[E_{Tot}][S]^2}{K_m^2+[S]^2}=frac{V_{max}[S]^2}{K_m^2+[S]^2}$
式中， $K_m^2=K_1K_2;V_{max}=k_4[E_{Tot}]$ 。式（34）就是Hill公式中n=2的情况。

一般地，考虑n重催化过程，有n个平衡常数 $K_1$ 到 $K_n$ 。当保持 $K_1K_2$ 为常数，并且 $Kn→0,K1→∞K_nrightarrow 0,K_1rightarrow infty$ 时，就可产生如下公式：
$V=Vmax[S]nKmn+[S]nV=frac{V_{max}[S]^n}{K_m^n+[S]^n}$
式中， $Kmn=∏i=1nKiK_m^n=prod_{i=1}^{n} K_i$ ，这就是著名的Hill公式。